Invest Ophthalmol Vis Sci.

Razionale: Il recettore del fattore di crescita endoteliale (VEGFR2) svolge un ruolo chiave nell’angiogenesi, processo in cui si ha la formazione di nuovi vasi a partire da quelli preesistenti. L’angiogenesi e i vari pathway che la regolano risultano alterati in molte patologie come la retinopatia diabetica proliferante e i tumori. I virus adeno-associati (AAV) sono dei piccoli virus, ad oggi non collegati a nessuna malattia nota, i cui vettori ricombinanti (rAAV) hanno promettenti usi nella terapia genica umana, in particolar modo in quella inerente alle malattie dell’occhio. Il sistema CRISPR/Cas9 è ad oggi il più potente strumento per riconoscere con altissima specificità sequenze del genoma umano ed effettuare inserzioni o deplezioni geniche, con un bassissimo indice di off-target. Il sistema CRISPR/Cas9 è un complesso formato da una nucleasi Cas9, che grazie ad una sequenza guida incorporata (gRNA) complementare alla sequenza di interesse, è in grado di riconoscerla ed effettuare un taglio specifico a doppio filamento del DNA.
Obiettivo: Questo lavoro si propone di esaminare se il sistema AVV-CRISPR/Cas9 può essere impiegato per sopprimere l’espressione di VEGFR2 in cellule endoteliali umane vascolari (HREC) in vitro e valutare gli effetti di tale deplezione sul downstream del recettore.
Metodi:  In questo studio è stato utilizzato un sistema doppio di vettori, uno contenente la caspasi Cas9 (SpCas9) e uno la sequenza guida (SpGuide) complementare a quella codificante per VEGFR2. La sequenza target per il locus di VEGFR2 è stata individuata tra quattro potenziali, e quella a maggior efficienza (K7) è stata selezionata tramite l’impiego di un lentivirus (lenti-CRISPR v2 vector).
Entrambi i vettori, SpCas9 e SpGuide, avevano al loro interno il promotore ICAM2, specifico delle cellule endoteliali, in modo da poter ottenere un effetto che fosse cellula-specifico. Il vettore che fungeva da controllo negativo aveva al posto della sequenza target per VEGFR2 quella per il gene lacZ di E.coli.
Una volta costruiti, i vettori SpCas9 e SpGuide sono stati trasfettati nella linea cellulare 293T, utile a produrre dei vettori ricombinanti di tipo rAVV5, noti per l’alta efficacia di trasfezione in cellule endoteliali.
I vettori rAVV5-SpCas9 e rAVV5-VEGFR2 così prodotti sono stati trasfettati in HREC stimolate o meno con VEGF. Successivamente alla verifica della riduzione di espressione del recettore, sono stati valutati gli effetti sul pathway di Akt, sulla proliferazione e migrazione cellulare e sulla capacità di ridurre la formazione di strutture vasali in vitro.
Risultati: Il legame del VEGF al suo recettore induce la fosforilazione della via di segnale di Akt, la quale svolge un ruolo chiave nella proliferazione e migrazione cellulare. Le HREC trasfettate con rAVV5-SpCas9-VEGFR2, quando stimolate con VEGF, mostrano ridotti livelli di Akt fosforilato, ridotta migrazione, proliferazione e abilità di formare strutture di tipo vasale in vitro, contrariamente alle cellule trasfettate con il controllo negativo lacZ o a quelle non trattate con VEGF.  
Conclusioni: Il rAVV-CRISPR/Cas9 è in grado di riconoscere la sequenza genica del VEGFR2, indurne la deplezione nelle cellule endoteliali retiniche, bloccare l’attivazione di Akt e la risposta cellulare intrinseca allo stimolo del VEGF, rappresentando un potenziale strumento terapeutico per la patologie vascolari.
Commento editoriale: La grande precisione ed efficienza con cui il sistema di CRISPR/Cas9 riesce ad individuare la sequenza target del VEGFR2 e indurne la deplezione, fa sì che questa metodica possa essere, in futuro, considerata come degna sostituta delle attuali terapie anti-VEGF, che, se pur efficaci, non sono in grado di indurre una risposta ottimale in molti pazienti.  La tecnologia CRISPR/Cas9 apre le porte alla forma più precisa ed efficace di editing del genoma umano. Bisogna tuttavia tener conto che le modificazioni genomiche sono permanenti e che vi può essere una percentuale bassa di mutazioni off-target, tali da ridurre l’integrità cellulare e creare cellule potenzialmente oncogeniche. Si rende quindi necessaria una costante ricerca per migliorare i risultati ed effetti di questa potentissima metodica.

A cura di Aurora Mazzeo, Elena Beltramo e Massimo Porta per il Gruppo di Studio Complicanze Oculari del Diabete

Wu W; Duan Y; Ma G; Zhou G; Windhol C; D'Amore PA; Lei H. AAV-CRISPR/Cas9–Mediated Depletion of VEGFR2 Blocks Angiogenesis In Vitro. IOVS 2017, 58: 6082-6090. doi:10.1167/iovs.17-21902